结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则[大全5篇]

第一篇：结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则

附件 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，如不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应（即γ-干扰素释放试验，IGRAs）的主要原理：受到结核分枝杆菌抗原刺激致敏的T淋巴细胞（T细胞）再次遇到相同抗原时可产生γ-干扰素，IGRAs通过检测全血或者分离自全血的外周血单个核细胞（PBMC）在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下产生的γ-干扰素，判断受试者是否存在结核分枝杆菌感染。目前，国际上较成熟的IGRAs有两种：一是采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ-干扰素水平；

二是采用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）方法测定在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放γ-干扰素的效应T细胞数量。

上述两种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，采用的结核分枝杆菌特异性抗原主要存在于结核分枝杆菌复合群中，在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失。

目前，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指：利用免疫学检测技术，如ELISA或ELISPOT技术等，以结核分枝杆菌特异抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素为检测靶标，对人静脉全血中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测的试剂，可用于结核分枝杆菌感染的检测或用于结核病的辅助诊断。本指导原则所述内容是针对结核病辅助诊断预期用途的，对于预期用途为结核分枝杆菌感染检测的申报试剂，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。

本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于其他方法，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从预期用途、方法学、检验原理、结核分枝杆菌特异性刺激抗原以及最低检测限等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。如所用刺激抗原为新发现的结核分枝杆菌特异性抗原，则应详细论述其能提高该类试剂灵敏度和特异性的科学依据，并提供充分的支持资料。

综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号，以下简称44号公告）的相关要求。

（二）主要原材料的研究资料 应提供主要原材料如抗原肽/重组抗原、抗体、阴性对照、阳性对照、标准品（γ-干扰素）、酶以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。如主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；

如主要原材料购自其他供应商，应提供的资料包括：供应商提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。

企业参考品：申请人应提供企业参考品的详细的来源、制备和确定等资料。

对于采用ELISPOT方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品。其中，阳性参考品建议采用结核病患者（菌阴和菌阳）的全血，阴性参考品建议采用健康人和其他易混淆疾病患者的全血，精密度参考品建议采用结核病患者的全血。如申请人采用除全血之外的其他样本形式作为企业参考品，请提交申请人所采用的企业参考品的组成、来源、稳定性、延续性、性能可控性等详细的理论和试验数据。

对于采用ELISA方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、线性参考品、准确度参考品和精密度参考品等。其中，阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品的设置可参考ELISPOT方法申报试剂的相关要求。最低检测限参考品、准确度参考品和线性参考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干扰素的溶液（建议采用血浆作为基质溶液）。

对于阴性/阳性对照：申报试剂的质控体系通过设置阳性、阴性对照来实现，申报资料应详细描述各种对照的原料选择、制备、定值过程等试验资料。本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于采用上述方法学的结核细胞类检测试剂，建议至少设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般采用外周血单个核细胞非特异性刺激物，用于质控外周血单个核细胞功能是否正常，避免产生假阴性。阴性对照用于控制细胞在活化过程中所产生的各种因子的非特异性影响，避免产生假阳性。

标准品（如适用）的选择及质量标准：应详细描述标准品原料的来源、制备、纯度、浓度（或复溶后浓度）、分子量、功能活性等的确定和验证资料。

多肽/重组抗原的选择及质量标准：应详细描述多肽的来源（来自何种抗原）/重组抗原的来源、组成、分子量、纯度、浓度、重组抗原的内毒素含量、刺激活性、特异性等的确定和验证资料。如为冻干抗原，还应设置水分含量的质控标准。

抗体的选择及质量标准：应详细描述抗体的来源、纯度、浓度、分子量、刺激免疫原、效价和功能活性等的确定和验证资料。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料 主要生产工艺包括：配制工作液、分装和包装等，可用流程图表示。应提供主要生产工艺的确定依据，包括试验方法和数据等。

反应体系研究资料应能对产品说明书中检验方法部分涉及的基本内容，如样本用量、试剂用量、反应条件等，提供确定的依据，包括试验方法和数据等。

（四）分析性能评估资料 申请人应提交对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法、内控标准、实验数据和统计分析等。对于结核分枝杆菌细胞免疫反应检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。

1.对于采用ELISA方法的申报试剂 检验方法分为两大部分：（1）将结核分枝杆菌特异性抗原与全血样本共培养，获得含有γ-干扰素的血浆样本；

（2）以γ-干扰素标准品做标准曲线，对第（1）步的血浆样本采用ELISA方法进行定量检测。基于该方法学的分析性能，需要对上述两方面的性能均进行验证。

1.1最低检测限 申请人可采用合理方法确定和验证申报试剂的最低检测限。建议采用含有系列γ-干扰素稀释浓度的样本，对每个浓度样本进行多次重复检测，选取测定平均OD值-2SD大于0浓度测定平均OD值+2SD的浓度作为最低检测限浓度。

1.2线性范围 线性范围确定的研究应使用高值样本（采用血浆基质，采用可溯源至国际校准品的方法对血浆样本中的γ-干扰素进行定量）进行梯度稀释，稀释液应使用血浆，应包含接近最低检测限的临界值浓度。通过评价一定范围内的线性关系确定申报试剂的线性范围。

1.3准确度 可采用如下方法进行评价，如：与国际标准品的偏差分析、回收试验或者方法学比对等方法，申请人可根据实际情况选择合理方法进行研究。

1.4分析特异性 1.4.1交叉反应 交叉反应的验证主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建议在0浓度γ-干扰素水平和中浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。

1.4.2干扰物质 应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用含有不同浓度γ-干扰素的血浆样本分别进行干扰物质的验证，给出不会对γ-干扰素检测值产生干扰的最高干扰物浓度。

1.5精密度 1.5.1采用全血样本进行试验的精密度：分别采用阳性全血样本和阴性全血样本，进行不少于10次重复检测，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。

1.5.2采用含有γ-干扰素的血浆样本进行试验的精密度：建议在γ-干扰素低浓度和中等浓度2个浓度水平分别进行验证。

1.5.2.1低浓度样本：γ-干扰素浓度略高于试剂盒的最低检测限（n≥20）。

1.5.2.2中等浓度样本：采用中等浓度的样本进行重复检测，CV≤15%（n≥20）。

1.5.3申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

1.6阴性参考品符合率 建议选择至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血样本进行试验，上述健康人和患者应包括不同等级的结核菌素（PPD）皮试人群。

1.7阳性参考品符合率 建议选择至少20份结核病患者（至少10例菌阳，至少10例菌阴）全血样本进行试验。

1.8标准品的溯源资料 γ-干扰素具有国际标准品，建议检测结果的量值溯源至国际标准品。申请人应提供从国际标准品到产品标准品的溯源链以及各级赋值资料。

2.对于采用ELISPOT方法的申报试剂 检验方法为：将结核分枝杆菌特异性抗原与分离的外周血单个核细胞（PBMC）共培养，活化刺激PBMC分泌的γ-干扰素被微孔板上包被的单克隆抗体捕获，再用酶标记的另一个单克隆抗体进行反应显色，一个斑点即代表一个细胞，计数斑点的多少，从而判断是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。基于该方法学的分析性能，需从下述几个方面进行性能验证。

2.1分析特异性 2.1.1交叉反应 交叉反应的验证主要考虑PBMC刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建议在0浓度γ-干扰素水平和中浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。

2.1.2干扰物质 应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用全血样本进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。

2.2精密度 采用全血样本（包括高斑点数样本、中等斑点数和低斑点数样本）分别进行精密度评价，进行不少于10次重复试验，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。同时，还应计数检测孔斑点数，计算其CV值，CV值应≤25%。

申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

2.3阴性参考品符合率 建议选择至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血样本进行试验，上述健康人和患者应包括不同等级的结核菌素（PPD）皮试人群。

2.4阳性参考品符合率 建议选择至少20份结核病患者（至少10例菌阳，至少10例菌阴）全血样本进行试验。

（五）阳性判断值的研究资料 此类试剂的阳性判断值较为复杂，阳性判断值对应产品说明书中“检验结果的解释”部分的内容，申请人应对产品说明书中“检验结果的解释”部分所涉及的各个数值提供详细的确定和验证资料。该部分资料应采用临床样本进行试验，请注意临床样本的选择应与申报产品声称的预期用途相一致。建议采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行确定。

（六）稳定性研究资料 稳定性包括申报试剂稳定性和样本稳定性（包括全血样本稳定性和血浆样本稳定性）。前者主要包括实时稳定性（有效期）、开封稳定性及冻融次数限制（如适用）等。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（七）临床试验 临床试验总体要求及临床试验资料的内容应符合《办法》、44号公告和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的规定，以下仅结合结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的具体特点对其临床试验中应重点关注的内容进行阐述。

1.临床试验机构的选择 申请人应当选定不少于3家（含3家）临床试验机构，按照法规要求开展临床试验。

2.对比试剂的选择 对于预期用于结核病辅助诊断的申报试剂，申请人可选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称申报试剂）与对比试剂进行比较研究试验，证明本品与已上市产品等效。

3.临床试验对象的选择 对于预期用于结核病辅助诊断的申报产品，临床试验对象应满足：（1）临床试验总病例至少1000例；

（2）具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者；

（3）最终临床诊断为结核病患者的病例中，应包括肺结核患者和肺外结核患者，并且涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例不应小于50%；

单纯肺外结核患者至少30例；

（4）非结核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例（最终临床诊断不是结核病），包括肺炎、肺癌、支气管炎、支气管扩张、非结核分枝杆菌病、慢阻肺等，其中肺癌至少50例；

（5）上述人群应包括PPD阴性和阳性人群，不能人为选择PPD阴性人群进行临床试验；

（6）各临床试验机构的样本量和样本分布应相对均衡。

全血样本不能冻融，临床试验应采用新鲜样本，样本采集和保存等应满足申报试剂和对比试剂说明书的相关要求。

4.临床试验方法、临床原始数据及统计分析 4.1分别依据申报试剂和对比试剂各自的说明书对入组临床样本进行检测，记录结果。

4.2临床报告中应明确：总样本例数；

临床诊断为肺结核患者的总例数，说明涂片阴性和涂片阳性的肺结核患者例数；

肺外结核患者的例数，说明各类肺外结核患者的例数；

非结核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病样本例数，并详细说明各类非结核疾病的患者例数。

4.3临床原始数据应以列表的方式表示，包括每个病例样本的年龄、性别、临床诊断结果、申报试剂的结果以及对比试剂的结果等。

4.4对临床试验数据的统计应选择合适的统计方法，如受试者工作特征（ROC）曲线分析、阴性/阳性符合率等。常选择四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。

4.5申报试剂对涂片阴性的肺结核患者和肺外结核患者均应有一定的检出率。

5.结果差异样本的验证 对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用临床上公认较好的第三方试剂或其他合理方法进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

6.临床试验方案 各临床试验机构的方案设置应保持一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申请人的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉试验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的样本入选/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。

7.其他问题 如果申报试剂的预期用途为结核分枝杆菌感染的检测，申请人应按照法规要求，设置合理的对比方法，选择合适的预期适用人群，进行临床试验。

（八）产品技术要求 产品技术要求应符合《办法》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关规定。内容主要包含产品性能指标和检验方法，并在附录中明确主要原材料、生产工艺及半成品检定要求。

对于采用ELISA方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、线性、准确度、最低检测限和精密度等。对于采用ELISPOT方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密度。

（九）产品注册检验报告 根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。

（十）产品说明书 产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书一致，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致。结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂说明书的重点内容进行说明。

1.【预期用途】 应至少包括以下几部分内容：

1.1本产品用于体外定性检测人新鲜外周静脉抗凝血中结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应，用于结核分枝杆菌感染的检测或者用于结核病的辅助诊断（根据临床试验等研究资料确认预期用途）。

1.2说明与预期用途相关的临床适应症背景情况，说明相关的临床或实验室诊断方法。

1.3待测人群特征介绍：具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者、地域要求或年龄限制（如有）等。

2.【主要组成成分】 2.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。

2.3申报试剂的注册单元不应包含真空采血管，真空采血管应按相应法规申报注册。

3.【检验原理】 3.1说明试剂盒所用的刺激抗原/抗原肽（名称、是否多肽抗原/重组抗原），以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非结核分枝杆菌中的存在情况。

3.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。

4.【储存条件及有效期】 说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复融稳定性、冻融次数要求（如适用）等，应明确具体的储存条件及有效期。

5.【样本要求】 重点明确以下内容：

5.1样本的采集：明确所用抗凝剂。

5.2样本的保存：

5.2.1对于采用ELISPOT方法的申报试剂，应明确：全血样本进行外周血单个核细胞分离前的保存温度与时间；

分离后外周血单个核细胞在与抗原孵育培养前的保存温度与时间。

5.2.2对于采用ELISA方法的申报试剂，应明确：全血样本在与抗原孵育培养前的保存温度与时间。

6.【检验方法】 该类产品的检测步骤繁多，应详细描述从全血采集开始到结果判读前的每个步骤，并明确注意事项。重点关注以下问题：对于采用ELISPOT方法的申报试剂，明确培养时所用外周血单个核细胞的数量以及所用培养基类型。

7.【检验结果的解释】 结合阳性对照、阴性对照以及样本管检测结果，以列表的形式对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述，明确灰区结果的处理方式。

8.【检验方法的局限性】 8.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

8.2有关假阴性结果的可能性分析，如：某些免疫功能受损的患者，可能导致假阴性。

8.3有关假阳性结果的可能性分析，如：与其他分枝杆菌是否存在交叉反应。

9.【产品性能指标】 9.1最低检测限（如适用）：说明试剂的最低检出浓度，简单介绍最低检测限的试验方法及结果。

9.2企业阴阳性参考品的检测符合情况：简单介绍阴阳性参考品的组成和符合率结果等信息。

9.3精密度：明确精密度参考品的组成及结果。

9.4分析特异性 9.4.1交叉反应：明确可能产生交叉反应的其他细胞因子的验证情况。

9.4.2干扰物质：明确样本中常见干扰物质对检测结果的影响。

9.5对比试验研究（如有）：简要介绍对比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

9.6境外（如适用）和境内临床试验数据总结。

《结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则》编制说明 一、编制背景 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指利用免疫学检测技术，如ELISA或ELISPOT技术等，以结核分枝杆菌特异抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素为检测靶标，对人静脉全血中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测的试剂，可用于结核分枝杆菌感染的检测或用于结核病的辅助诊断。

本指导原则所述内容是针对结核病辅助诊断预期用途的，对于预期用途为结核分枝杆菌感染检测的申报试剂，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。

二、重点问题的说明 （一）企业参考品的组成和样本类型 目前，该类试剂采用全血样本作为检测样本类型，所涉及的方法学包括：ELISPOT和ELISA。针对企业参考品的样本类型，考虑到全血样本的不可冻存性和该类试剂质控的关键点，指导原则建议：如申请人采用除全血之外的其他样本形式作为企业参考品，应提交申请人所采用的企业参考品的组成、来源、稳定性、延续性、性能可控性等详细的理论和试验数据。

针对企业参考品的组成，由于ELISPOT方法是在全血细胞培养后，直接在固体基质表面形成斑点，计数斑点判断结果，理论上可计数一个斑点。但在实践时，很难保证获取的全血样本刚好形成一个斑点，因此，采用该方法学的试剂仅需要设置阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品。而ELISA方法是在全血培养后，吸出血浆上清，检测上清中的干扰素的含量，因此，采用该方法学的此类试剂需要设置培养阶段和干扰素ELISA检测阶段参考品，包括：阴性参考品、阳性参考品、线性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品等。

（二）分析性能评估相关问题 1.最低检测限的要求与方法 采用ELISPOT方法的试剂，理论上可计数到一个斑点，因此理论上其最低检测限为1个斑点，但现实中通过试验证明该类试剂的最低检测限为1个斑点具有很大困难，难以实现。因此，参考美国FDA已批准同类试剂的要求，经讨论后，对ELISPOT方法学的此类试剂，无需进行最低检测限的验证。

采用ELISA方法的试剂，最低检测限检测的是血浆样本中干扰素的最低含量。指导原则建议，申请人可根据自己的研发平台，设置科学合理的方法，进行最低检测限的试验。

2.精密度的要求与方法 采用ELISPOT方法的试剂，精密度必须采用全血进行试验，方可模拟整个检测过程。在讨论日间精密度时，企业和相关专家均提出，因为全血样本无法冻存，无法在不同的自然天内进行日间精密度的研究。同时，现有认知水平下，也无科学合理的替代方法来进行日间精密度的研究，因此，对此类试剂不做日间精密度的要求。

采用ELISA方法的试剂，精密度不仅需要考察全血培养阶段的精密度，而且需要考察ELISA检测部分对干扰素含量检测的精密度，前者可参考ELISPOT方法的相关要求和方法，后者参考常见ELISA方法检测试剂的要求和方法。

3.交叉反应的要求与方法 采用ELISPOT方法和ELISA方法的试剂，尽管结果的判读方式存在差异，但其检验原理均是采用特异性的γ-干扰素抗体，检测T细胞刺激活化后分泌的γ-干扰素。因此，此类试剂的交叉反应性，主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。

如果在全血样本的培养过程中加入可能产生交叉反应的细胞因子，势必会影响T细胞在培养过程中的功能和活性，最终影响T细胞分泌γ-干扰素的能力，影响对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应的检测。因此，对于该类试剂，不管是采用何种方法，交叉反应的研究都是采用血浆或其他基质检测细胞因子对γ-干扰素抗体对的交叉反应性。

（三）产品预期用途 该类试剂的检测原理可检测结核分枝杆菌的感染，包括活动性结核感染（结核病）和潜伏感染。但是，因为潜伏感染的诊断在全世界均无金标准，而且中国人出生就接种卡介苗，导致对潜伏感染预期用途的临床验证目前缺乏有效的对比方法，因此，目前申请人申报该类试剂的预期用途基本用于结核病的辅助诊断。本指导原则针对结核病辅助诊断预期用途的临床试验要求，给出了较为详细的建议，并经专家和企业讨论后，达成了一致意见。

同时，指导原则也明确，如果申请人对该类试剂的预期用途设定为结核分枝杆菌感染的检测，需提供足够的临床证据支持该声称。

（四）临床试验相关问题 1.样本入组相关要求 针对结核病辅助诊断的预期用途，指导原则在临床试验样本入组方面做了较为详细的说明。申报试剂应选择疑似结核患者进行检测，以模拟临床实际使用情况。临床使用中，该类试剂不仅用于肺结核的辅助诊断，还可用于肺外结核的辅助诊断，因此，指导原则对单纯肺外结核的样本例数也给出了最低要求。鉴于临床实践和研究证明，肺癌患者是一类与γ-干扰素相关的癌症，因此，规定了肺癌患者的最低样本例数，以考察该类试剂的特异性。

2.临床特异性的相关要求 指导原则初稿时，对申报试剂的临床特异性做出了不低于75%的要求。后经专家和企业反复讨论后删除了这一要求，原因有以下几点：第一，该类试剂已有多个同类产品在国内外批准上市，按照法规要求，可选择已上市同类试剂，验证该类试剂的检测准确性；

第二，该类试剂的临床特异性受临床试验受试人群的年龄、性别以及区域的影响较大，而且目前并无大量流行病学的调查数据支持75%的声称，因此，临床特异性无法给出具体要求。

三、编写单位 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心。

第二篇：酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

附件1

酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

一、前言

本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。

本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。

三、基本要求

（一）基本原则

1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。— 2 — 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制 1.主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生

— 3 — 物原料应具备相应外观标准。

（2）纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位臵。

（3）蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。

（4）效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

（5）功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2.生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：

（1）牛血清或羊血清

外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物。无菌试验：将血清直接37℃放臵7天，明亮处观察，不得出现混浊或— 4 — 沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在1826℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。

总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。（3）酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。3.化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材

— 5 — 料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

4.其他物料（1）酶标板 ①外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。②吸附能力和精密性 采用合适的方法进行检验。

一般用一定浓度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。

（2）液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

（3）其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。— 6 — 5.企业质控品

企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、钩状效应（hook效应）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

（三）试剂盒各组分的生产

酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

1.各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的

— 7 — 功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

2.包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内臵干燥剂），保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

3.分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的标准操作规程要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

（四）质量控制 1.半成品质量控制（1）半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各— 8 — 组分，作号标记、待检。

（2）半成品检验

根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和定量质控品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

2.成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。

（1）成品检验

成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家

— 9 — 标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

四、名词解释

酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。

五、参考文献：

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社

— 10 —

第三篇：地中海贫血相关基因检测试剂注册技术审查指导原则（2020年）

附件3

地中海贫血相关基因检测试剂

注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对地中海贫血相关基因检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对地中海贫血相关基因检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究和验证资料，相关人员应在遵循法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

地中海贫血（简称地贫）是一种常染色体隐性遗传病，是由于珠蛋白基因发生突变（包括点突变和缺失等），致使珠蛋白肽链合成减少或完全不能合成而导致的一组单基因遗传性溶血性疾病，轻者可无临床表现，重者以进行性溶血性贫血为主要特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，地贫分为α-，β-和γ-地贫等，临床上最常见的是α-和β-地贫。地贫主要分布在地中海沿岸、东南亚和少数非洲地区，具有明显的种族特性和地域分布差异。地贫是我国南方地区最常见、危害最大的遗传病之一，尤以广西、云南、广东、海南、四川和贵州等省份为甚，云南、海南和广东的地贫基因人群携带率可达10%以上，广西更是达到了20%以上。

α-地贫主要是由于α-珠蛋白基因发生突变而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎儿期和成人期表达的2个基因（α2和α1），基因的排列顺序为5’-α2-α1-3’。根据单倍型的情况，可将α地贫分为3类：（1）缺失型α+地贫（-α/），缺失1个α基因；（2）缺失型α0地贫（--/），2个α基因同时缺失；（3）非缺失型α+地贫（αTα/或ααT/），1个α1或α2基因发生点突变或少数几个碱基的缺失。中国现已发现至少19种α-珠蛋白基因大片段缺失和38种α-珠蛋白基因点突变。其中，6

种α-珠蛋白基因的突变：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群总数的98%。

α-地贫基因型和临床分型的关系已经基本阐明。α-地贫的表型严重程度随着功能性α-珠蛋白基因的减少而加重：（1）1个α-基因缺失或点突变（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），称为静止型α-地贫，通常不贫血，血液学表现为小细胞低色素；（2）2个α-基因缺失或复合-α基因点突变，或点突变，其基因型为--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，称为轻型α-地贫，临床表现为不贫血或轻度贫血，血液学检查有小细胞低色素特征；（3）3个α-基因缺失或复合α基因点突变，基因型为--/-α或--/αTα，称为中间型α-地贫，又称Hb

H病，患者有轻至重度贫血。某些基因型为αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表现为Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病较单纯缺失型Hb

H病（--/-α）的临床表现更为严重，特别是基因型为--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，贫血程度较为严重；（4）4个α-基因缺失，其基因型为--/--，称为重型α-地贫，又称Hb

Bart’s胎儿水肿综合征，此类个体一般无法存活到出生或分娩后半小时内死亡。

β-地贫是由于β-珠蛋白基因发生突变而引起，以点突变为主，少数为缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2个成人期表达基因（β和δ），基因的排列顺序为5’-δ-β-3’。根据β-珠蛋白链合成量的程度，可将β-地贫分为3类：（1）β0地贫，β-珠蛋白链完全不能合成，其所在的等位基因称为β0地贫等位基因；（2）β+地贫，β-珠蛋白链合成减少，其所在的等位基因称为β+地贫等位基因；（3）β++地贫，又称沉默型β-地贫，β-珠蛋白链合成轻微减少。中国已至少报道84种β-珠蛋白基因点突变和11种β-珠蛋白基因缺失。其中，6种点突变：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突变类型的90%以上。

β-地贫的临床表型可分为4种：（1）静止型β-地贫，基因型为β++/βN，血液学表型正常或临界，一般只能通过分子诊断识别；（2）轻型β-地贫，基因型为β0/βN或β+/βN，临床表现为小细胞低色素和HbA2值升高；（3）中间型β-地贫，基因型为β+/β+或β+/β0，表型变异范围大，可从轻度贫血到中度贫血，多于幼儿期出现中度贫血；（4）重型β-地贫，基因型为β+/β0或β0/β0，通常伴有严重贫血，需要定期输血才能存活。患儿出生时无症状，常于婴儿期（3-12月龄）发病。如不治疗，患儿多于5岁前死亡。此外，中间型的分子基础较为复杂，显性β-地贫突变的杂合子（βD/βN），合并α-地贫突变的β-地贫突变纯合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三联体的β-地贫突变杂合子（β0/βN或β+/βN），也会显示中间型的表型。

2018年发布的《重型β-地中海贫血的诊断和治疗指南》明确规定：对于重型β-地中海贫血的诊断，有条件者均应进行基因诊断，基因型为纯合子或双重杂合子为确诊本病的指标。2018年发布的《儿童非输血依赖型地中海贫血的诊治和管理专家共识》也明确规定：地贫基因检测为非输血依赖型地贫的诊断依据之一。

另外，国家卫生健康委员会发布的相关文件要求：为减少重型地贫患儿出生，在我国地贫高发省份实施地贫防控试点项目。主要流程包括：（1）对新婚夫妇和计划怀孕夫妇在怀孕前或孕期进行血常规初筛；（2）对夫妇一方或双方血常规检查结果阳性的夫妇进行血红蛋白分析复筛；（3）对血红蛋白分析复筛结果均为阳性的夫妇，取其抗凝静脉全血进行相应的α+β地贫基因检测；（4）综合夫妇双方病史询问、地贫筛查和基因检测结果，判定为高风险夫妇。对高风险夫妇进行追踪，及时了解受检妇女怀孕情况，指导女方在怀孕后适宜时期接受产前诊断。产前诊断的对象为胎儿，样本类型为胎儿的绒毛、羊水和脐带血，检测项目为相应的地贫基因检测。

综上，结合该类产品临床使用的实际情况，本指导原则的预期用途可为：用于体外定性检测人外周静脉全血或胎儿羊水等样本中基因组DNA的α-和/或β-地贫相关基因，用于α-和/或β-地贫的辅助诊断（遗传诊断），地贫高风险夫妇的评估，或胎儿的产前遗传诊断等。

结合该类产品在中国注册的实际情况以及当前的认知，本指导原则仅对“α-和/或β-地贫的辅助诊断（遗传诊断）”预期用途的相关内容进行了详细阐述。针对其他预期用途，本指导原则仅对部分内容进行了阐述，申请人应根据产品特性，对本指导原则未涉及的内容进行补充并做出相应评价。

本指导原则的技术要求是基于PCR探针法方法建立的，对于其他分子生物学检测技术（如：PCR-反向点杂交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。

本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、检测的突变类型以及临床意义等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。

综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（原总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（原总局公告2014年第44号），以下简称《44号公告》的要求。

（二）主要原材料的研究资料

主要原材料研究资料包括主要反应成分、对照品（质控品）及企业参考品的研究资料。

1.此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、检测所需引物、探针、酶、dNTPs、反应缓冲液等。申请人应提交相关原材料的选择、制备和质量标准等的研究资料。如为申请人自制，应提交详细的工艺稳定性研究资料；如为外购，还应提交供应商筛选资料以及供应商提供的原材料质量检定报告。

1.1

核酸提取/纯化试剂（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

1.2

引物、探针

申请人应详述引物、探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计多套引物探针以供筛选，针对待测位点的特异性等进行评价，选择最佳设计，并提交详细的筛选研究数据。

申请人应针对选定的引物、探针原材料进行质量评价，一般包括：分子量、纯度（HPLC等）、浓度、探针荧光标记基团的激发波长和发射波长，以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申请人应针对各种酶的活性进行验证，提交功能性试验资料，并确定酶的质量标准。

DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性。UDG/UNG应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。

1.4脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料，以及功能性试验资料，并确定质量标准。

2.对照品（质控品）

试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现。阳性对照应至少包括代表性的突变位点和突变类型。阴性对照可以是含有野生型序列的核酸溶液。空白对照为不含核酸的溶液。

如该类产品所采用的方法学和检验原理显示：无论检测何种样本（野生型、杂合突变和纯合突变），其反应体系均可报出核酸序列结果，均可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，则无需另外设置内标；否则，试剂盒应另外设置内标。

对照品可采用人基因组DNA、细胞系或质粒等。空白对照应参与样本核酸的平行提取。申请人应提供对照品原料选择、制备、定值过程等的详细研究数据，并对其检测结果做出明确的范围要求。

3.企业参考品

企业参考品主要包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和精密度参考品等。申请人应提交企业参考品的原料选择、制备方法、基因序列确认及检验标准的详细研究资料等。

3.1

阳性参考品：可采用临床样本或其核酸溶液，如采用临床样本，则样本类型应与待测样本一致。应至少包含所有检测位点的杂合型样本，同时尽量纳入纯合突变型样本。对于某些稀有基因型，也可采用细胞系或质粒。

3.2

阴性参考品：应包括野生型临床样本或其核酸溶液，以及易产生交叉反应的同源序列样本，同时应尽量包含检测范围外其他检测位点的样本等。

3.3检测限参考品可选择最低检测限浓度（例如：95%检出率水平）或接近最低检测限浓度（例如100%检出率水平）的临床样本或其核酸溶液，至少包含所有检测位点的杂合型样本。

3.4

精密度参考品应至少包括低浓度杂合突变型临床样本或其核酸溶液，应至少包括代表性的突变位点和突变类型，且在每一反应体系均有分布。

目前，该类产品已有国家参考品，对于申报产品所声称的检测位点，企业参考品的要求应不低于国家参考品。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

主要生产工艺研究资料包括工作液配制（引物、探针浓度、酶浓度、dNTPs浓度、缓冲液离子浓度等）、分装和冻干（如有）、荧光标记（如有）等工艺过程的描述及确定依据。生产过程应对关键参数进行有效控制，可采用流程图方式描述生产工艺，标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。

反应体系研究指反应条件的选择确定过程，包括样本采集、预处理（如有）、样本用量、试剂用量、核酸提取纯化步骤、PCR反应条件、阈值循环数（Ct值）等的确定。

不同适用机型的反应条件如有差异应分别提交。

（四）分析性能评估资料

申请人应针对下述各项分析性能提交详细的评估资料，包括试验地点、适用仪器、试剂规格、批号、试验方法、试验样本（类型、来源、数量、处理方法、基因型和浓度确认等）、可接受标准、统计方法、试验数据及结论等。分析性能评估的实验方法可以参考国内外有关体外诊断产品性能评估的指导原则。

每项性能评估应尽量采用与适用样本类型一致的临床样本，对于某些稀有基因型，也可采用细胞系等。

1.核酸提取/纯化性能（如有）

在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸提取/纯化步骤。该步骤应最大量分离和纯化目的核酸并尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸提取/纯化组分，申请人都应对配套使用的核酸提取/纯化方法的提取效率和提取核酸纯度、浓度等做充分的验证，并评价该方法能否满足该类产品的要求。

2.检测准确性

建议采用若干份临床样本验证该类产品的检测准确性，样本类型与说明书声称的样本类型一致。样本应涵盖野生型、所有检测位点的杂合突变型，同时尽量纳入纯合突变型。对于某些稀有基因型，也可采用细胞系或质粒。

3.最低检测限

该类产品的最低检测限可定义为：在满足一定的检测准确性和精密度的条件下，能够检出目标序列的最低人基因组DNA的浓度。可采用梯度浓度的人基因组DNA样本进行多次重复检测，确定适当检出率水平（如：95%）下的最低人基因组DNA浓度。检测限评价建议采用临床样本或细胞系，并至少包含所有检测位点的杂合突变型。应明确临床样本或细胞系与人基因组DNA浓度的对应关系。

4.分析特异性

4.1

应针对同源序列或检测范围外基因和位点进行交叉反应验证，说明交叉反应样本的制备方法、核酸序列确认方法，提交详细的验证资料。

4.2

应针对可能的内源和外源性干扰物进行干扰试验研究。内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白和白蛋白、母体细胞的干扰等，外源干扰物主要包括血液样本采集可能用到的抗凝剂和常用药物等。

干扰试验可通过在临床样本中人工添加干扰物质的方式，评价干扰物质对目标序列检测的影响，也可直接采集暴露于干扰因素后的受试者样本，进行干扰试验评价。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价；如有干扰，应确定不产生干扰的最高浓度。

5.精密度

精密度评价应采用临床样本进行试验，试验操作完全按照说明书执行，包含核酸提取/纯化等步骤（如有）。应对每一反应体系进行精密度评价，并至少覆盖代表性的突变位点和突变类型。

精密度评价需满足如下要求：

5.1对可能影响检测精密度的主要因素进行验证，除检测试剂本身外，还包括分析仪器、操作者、地点、时间、检测轮次和试剂批次等。

5.2设定合理的精密度评价周期，对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间重复性进行评价。

5.3用于精密度评价的临床样本至少设置低浓度和中/高浓度水平。

5.4精密度指标可设置为CV等（如有），申请人应对精密度指标评价标准做出合理要求。

（五）阳性判断值确定资料

建议纳入一定数量的临床样本，应包括所有检测位点的各种基因型（野生型、杂合突变型，同时尽量纳入纯合突变型），采用受试者工作特征（ROC）曲线或其他合理方法确定阳性判断值。

如试剂判读存在灰区，应解释说明灰区范围的确定方法。

对于某些检测方法学，阳性判断值研究可能不适用，申请人应说明理由。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要包括申报产品的稳定性研究和适用样本的稳定性研究两部分。前者主要包括申报产品的实时稳定性、开瓶/复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制的研究等；后者则是指适用样本的保存条件和保存时间等的研究。

实时稳定性研究应采用至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后，选取多个时间点进行产品性能评价，从而确定产品保存条件和有效期。

如核酸提取液可保存，还需对核酸提取液的保存条件和保存时间进行研究。

（七）临床试验

应满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求，如相关法规、文件有更新，临床试验应符合更新后的要求。下面仅说明该类产品临床试验中应关注的重点问题。

1．针对“α-和/或β-地贫的辅助诊断（遗传诊断）”预期用途

1.1

临床试验机构及人员

申请人应根据产品特点及预期用途，综合不同地区人种和流行病学背景等因素，选择不少于3家（含3家）符合法规要求的临床试验机构开展临床试验。

1.2

临床试验适用人群和临床样本

具有地贫症状和/或体征，或血液学表现为小细胞低色素的疑似地贫患者和携带者；需与地贫进行鉴别诊断的其他疾病患者，如：缺铁性贫血、铁粒细胞性贫血或先天性红细胞生成异常性贫血等。

临床试验所用样本应为抗凝外周血样本（基因组DNA非临床样本）。临床样本的采集、处理、保存和提取等应分别满足申报产品说明书、对比试剂说明书（如适用）及第三方试剂说明书（如适用）的相关要求。

1.3临床试验方法

1.3.1已有同类产品上市的申报产品

对于已批准的α-地贫突变和β-地贫突变，原则上选择已上市同类产品作为对比试剂，评价申报产品的临床检测性能。

1.3.2无同类产品上市的申报产品

1.3.2.1

如新突变位点的临床意义已获行业认可（如：国内相关指南或专家共识），且上述认可基于充分的中国人群的临床数据，则临床试验可选择Sanger基因测序（针对新的点突变）或临床普遍使用的其他公认方法（针对其他类型的新突变位点，如缺失）作为对比方法，评价新突变位点的临床检测性能。除此之外，还应提交新位点临床意义已获行业认可的相关证据，该部分资料可不纳入临床方案和报告。

1.3.2.2

如新突变位点的临床意义未获行业认可，则临床试验应包括两个目的，新突变位点的临床检测性能评价和临床意义评价。新突变位点的临床检测性能评价可参考1.3.2.1；新突变位点的临床意义评价应提交基于中国人群的充分的临床证据，证明基因型与表型的关系，如：随访或其他可证明基因型与表型关系的临床验证资料。

1.4最低样本量和阳性例数

临床试验样本量应采用适当的统计学方法进行估算，并详细描述所使用统计方法及各参数的确定依据。

1.4.1

临床检测性能评价的样本量估算

临床检测性能评价的样本量估算可分为以下几种情况。

对于常见突变位点，建议采用单组目标值法分别估算每个突变位点临床试验的最低样本量，通过阳性符合率计算所需阳性样本的例数，通过阴性符合率计算所需阴性样本的例数，同时考虑脱落情况，估算最低样本总量。阳性符合率和阴性符合率的目标值（临床可接受的最低标准）建议均不低于95%。

对于罕见突变位点，阴性样本的例数可根据上述方法进行估算，阳性样本则应保证一定的例数。

对于极其罕见的、且有确切临床证据证明其临床意义的突变位点，阴性样本的例数可根据上述方法进行估算，阳性样本的例数则应结合临床证据确定。

1.4.2

新位点临床意义评价的样本量估算

新位点临床意义评价的样本量估算，建议采用抽样调查公式或其他合理方法进行估算。

2.针对“地贫高风险夫妇的评估”和“胎儿的产前遗传诊断”预期用途

针对上述两个预期用途，本指导原则仅对部分内容进行了阐述，申请人应根据产品特性，充分考虑本指导原则未涉及的内容，设计科学合理的临床试验并进行评价。

2.1临床试验机构和人员

如申报产品的预期用途为胎儿的产前遗传诊断，除满足法规要求外，临床试验机构还应取得产前诊断技术服务资质。临床试验人员应为经过专门培训的取得资质的人员。机构和人员应遵循《产前诊断技术管理办法》《母婴保健专项技术服务许可及人员资格管理办法》，机构应取得《母婴保健技术服务执业许可证》，人员应取得《母婴保健技术考核合格证书》。

2.2

临床试验适用人群和临床样本

如预期用途为地贫高风险夫妇的评估，则适用人群为：地贫表型筛查阳性的育龄人群。地贫表型筛查阳性的育龄人群可根据国家卫生健康委员会和地贫高发地区相关政策确定。

如预期用途为胎儿的产前遗传诊断，则适用人群为：地贫高风险夫妇的胎儿。地贫高风险夫妇的确定可参考国家卫生健康委员会等相关文件。

临床试验所用样本应为胎儿羊水等临床样本（基因组DNA非临床样本）。临床样本的采集、处理、保存和提取等应符合国家卫生健康委员会等相关文件的要求，并满足产品说明书的要求。

2.3

最低样本量和阳性例数

针对每种不同的预期用途，应分别采用合理方法估算最低样本量。同一预期用途的不同样本类型（羊水和脐带血等），也应分别采用合理方法估算最低样本量。

3.如有其他预期用途，也应设计科学的临床试验，提供充分的证据，证明其预期用途。

4.不同预期用途的通用要求

4.1

临床试验方法、数据及统计分析

4.1.1应在临床试验方案或报告中明确申报产品、对比试剂和第三方试剂的试验方法。

4.1.2临床试验病例总结表应以列表方式表示，包括申报产品的结果、对比试剂的结果、第三方试剂的检测结果（如有）、临床诊断、年龄和性别等。

4.1.3以交叉表分别总结两种试剂的定性检测结果，选择合适的统计方法进行统计分析，以验证两种试剂检测结果的一致性。

4.1.4

结果差异样本的验证

在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，采用合理方法进行复核，并对差异原因进行分析。如无需复核，应说明理由。

4.2

临床试验方案

各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由该实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程。

试验方案应确定严格的入选/排除标准，任何已入选的样本被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程和结果判定时，应采用盲法以保证试验结果的客观性。各临床试验机构选用的对比试剂/方法应保持一致，以便进行合理的统计学分析。另外，申报产品的样本类型不应超越对比试剂/方法对样本类型的要求。

4.3临床试验报告

应对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的数据和统计分析方法。

（八）产品技术要求

产品技术要求应符合《办法》、《44号公告》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关要求。该类产品作为三类体外诊断试剂，应将主要原材料、生产工艺及半成品要求等内容作为附录附于技术要求正文后。

目前，该类产品已有行业标准，产品技术要求的相关要求应不低于行业标准的要求。

（九）产品检验报告

根据《办法》的要求，第三类体外诊断试剂申请注册时应提交连续三个生产批次样品的检验报告。目前，该产品已有国家参考品，产品检验应满足国家参考品的要求。

（十）产品说明书

产品说明书应满足《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料的相关研究结果保持一致。下面对该类产品说明书的重点内容进行阐述。

1.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：

1.1本产品用于定性检测人xx样本基因组DNA中的α-和/或β-地贫xx突变，用于：α-和/或β-地贫的辅助诊断（遗传诊断），地贫高风险夫妇的评估，或胎儿的产前遗传诊断。

1.2介绍地贫相关的临床背景信息及实验室诊断方法等，介绍被测靶标（突变位点）的相关情况。

2.【主要组成成分】

2.1说明试剂盒包含组分的名称或数量等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称及其他相关信息。

2.3如果试剂盒中不包含用于核酸提取纯化的试剂组分，则应在此注明经过验证后配合使用的商品化核酸提取纯化试剂盒的生产企业、产品名称以和医疗器械备案号（如有）等详细信息。

3.【检验原理】

3.1对试剂盒的被测靶标进行详细描述（基因位置、突变位点及相关特征等），对试剂盒所用探针、引物或突变的判定等进行详细介绍；对不同样本反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行介绍。

3.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分（如UNG酶），也应对其作用机理进行适当介绍。

4.【储存条件及有效期】

说明试剂盒的效期稳定性等，应明确具体的储存条件及有效期等信息。

5.【样本要求】

样本的采集、处理、运送和保存：明确样本采集、核酸提取纯化前的处理（如离心和洗涤等）、保存条件及期限以及运送条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否需要恢复至室温，冻融次数的限制等。

6.【适用仪器】

所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

7.【检验方法】

详细说明实验操作的各个步骤，包括：

7.1实验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度和空调气流方向控制等注意事项。

7.2试剂配制方法和注意事项。

7.3详述核酸提取纯化的条件、步骤及注意事项（如适用），对核酸提取纯化环节进行合理质控，明确提取核酸的浓度纯度等质量要求。

7.4扩增反应前准备：加样体积、顺序等。

7.5

PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置或相应的自动化检测程序及相关注意事项。

7.6仪器设置（如适用）：特殊参数、探针的荧光素标记情况、对待测样本及其他对照品的荧光通道选择等。

8.【检验结果的解释】

结合对照品、样本管检测结果以及检测类型，以列表形式详述所有可能出现的结果及相应的解释。如存在检测灰区，应详述对于灰区结果的处理方式。

9.【检验方法的局限性】

9.1申报产品仅对下述检测类型xx进行了验证。

9.2有关假阴性结果的可能性分析

9.2.1不合理的样本采集、运送及处理或核酸过度降解均有可能导致假阴性结果。

9.2.2未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果（如有）。

10.【产品性能指标】简述以下性能指标：

10.1最低检测限：简单介绍最低检测限的确定方法，并明确最低检测限结果。

10.2阳性/阴性参考品符合率。

10.3精密度：简单介绍精密度的确定方法，并明确精密度结果。

10.4分析特异性

10.4.1交叉反应验证：同源性序列等交叉反应验证。

10.4.2干扰物质验证：样本中常见干扰物质对检测结果的影响。

10.5对比试验研究（如有）：简要介绍对比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

11.【注意事项】应至少包括以下内容：

11.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出具有潜在感染性的警告。

11.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》现行有效版本等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。

三、起草单位

国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心。

第四篇：抗人球蛋白检测试剂注册技术审查指导原则（2018年）

附件3

抗人球蛋白检测试剂注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对抗人球蛋白检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对抗人球蛋白检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容，可自行补充。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

抗人球蛋白检测试剂可进行直接抗人球蛋白试验和间接抗人球蛋白试验，主要用于不规则抗体筛查、交叉配血、抗体致敏红细胞的检测等。

本指导原则适用于抗人球蛋白检测试剂，同时适用于不同的检测方法，如试管法、柱凝集法等，但不适用于血源筛查用抗人球蛋白检测试剂。

本指导原则仅包括对抗人球蛋白检测试剂注册申报资料中部分项目的要求，适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜，应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）（以下简称《办法》）等相关法规要求。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料的撰写应符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）（以下简称“44号公告”）的相关要求。内容主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及同类产品在国内外批准上市的情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从灵敏度、特异性、效价、重复性等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的异同。

（二）主要原材料研究资料

主要原材料研究资料应包括主要组成成分（抗体、凝胶、玻璃珠等）的选择、制备及其质量标准的研究资料。

1.抗体的选择及质量标准

明确抗体的来源，如为单克隆抗体应明确细胞株、克隆号等内容。提供抗体灵敏度、特异性、效价等基本性能的验证资料。

抗体如为自行生产，提供抗体的详细生产及鉴定过程。

1.1灵敏度：已知抗体效价的临床有意义的血型系统至少7种血型抗体（IgG）的最高稀释倍数的凝集强度不小于1+。

1.2特异性：临床有意义的已知血型系统至少7种，每种选1个抗体（IgG），与对应的抗原阳性细胞均应检测阳性。

与不规则抗体阴性样本检测结果应为阴性。

1.3效价：如采用倍比稀释的方法验证抗人球蛋白试剂的效价，分别采用IgG和/或C3d致敏的细胞或根据厂家确立的研究方法进行验证。

2.填充物的选择：说明填充物如凝胶、玻璃珠的特性，如组成、粒径及其质量控制要求。应提交选择比较过程，提交验证试验资料。

3.填充缓冲液：应说明组成成分，并对外观、性状、pH值等物理指标及功能性进行研究验证。

4.液体试剂稀释液：应说明组成成分，并对外观、性状、pH值等物理指标及功能性进行研究验证。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1.主要生产工艺介绍，可用流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。

2.产品基本反应原理介绍。

3.主要生产工艺过程的研究资料、每一步生产工艺的确认资料及试验数据。如抗体浓度的选择确定过程、凝胶溶胀条件的确定、填充量及填充过程的研究资料，填充应确保均匀无气泡，以及质量控制的要求。

4.主要反应体系的研究资料、每一步反应体系的确认资料及试验数据。

反应体系的设置应符合《全国临床检验操作规程》等公认标准操作规范、指南或标准的要求。如红细胞悬液制备要求及红细胞浓度的确定、用量的要求、孵育时间等；应提交离心条件的研究资料，建议以离心力或固定离心机型号固定转数和时间的方式设置离心条件。

（四）分析性能评估资料

申请人应提交在产品研制或成品验证阶段对试剂进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评估的实验方法可以参考国内或国际有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行。

产品性能研究所采用的各种仪器、试剂或其他物品如可能均应采用境内或境外已批准上市的产品，如抗体筛查红细胞、血型抗体等。

分析性能评估试验中应明确所有试验每种试剂的用量、试剂红细胞的浓度、采用的试验方法（试管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有试验方法应符合配合使用的血型试剂的具体操作要求。

对于抗人球蛋白检测试剂建议着重对以下分析性能进行研究：

1.间接抗人球蛋白试验：

提供临床有意义的血型系统至少7种不规则抗体（IgG）检测灵敏度和特异性的验证资料，明确所检出抗体的抗体效价的具体要求，可参照以下要求进行实验。

1.1灵敏度

与已知抗体效价的血型抗体的最高稀释倍数的凝集强度不小于1+，并且抗体效价不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果。

C3d凝集强度≥2+。

1.2特异性

与已知抗体类型的血型抗体对应的O型相应抗原阳性红细胞的反应为阳性。

与已知抗体类型的血型抗体对应的O型相应抗原阴性红细胞的反应为阴性。

与C3d阳性或阴性样本反应为阳性或阴性。

1.3重复性

分别采用IgG性质抗D抗体，IgG性质抗Jka/Jkb抗体，IgG性质抗Fya/Fyb抗体进行重复性验证。

批内重复性采用同一批次检测卡重复进行检测，重复次数不少于10次。

日间重复性采用同一批次检测卡每日重复进行检测，重复天数不少于10天。

批间重复性采用至少三批检测卡进行重复检测。

批内、日间、批间重复性检测结果应基本一致，检测结果凝集强度差异不超过1+。

采用阴性结果的血清重复10次检测，均应出现阴性反应。

1.4干扰

提供溶血、脂血、黄疸干扰的评估资料，应至少采用强、中、弱性质的抗体进行评价。

1.5血清、血浆比对的评估资料。

1.6抗凝剂的适用性研究验证。

1.7采用部分临床样本进行检测灵敏度和特异性的评价，应考虑涵盖肿瘤、血液病、自身免疫病和贫血患者、老人及儿童等病例来源，应包括阳性和阴性病例。

1.8分别进行每个预期用途的完整的性能评估资料，应至少包括50例阳性病例。

2.直接抗人球蛋白试验

使用被不规则抗体和/或C3d致敏的红细胞进行反应，评价产品性能，适用的性能评价内容可以参照间接抗人球蛋白试验。

（五）阳性判断值

给出不同凝集强度的研究方法，并明确不同凝集强度代表的具体意义，并应包含溶血、混合视野双群等情况，明确具体的试验方法、实验步骤，提供不同凝集强度的图例或相片。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、加热稳定性、开瓶稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案，实验项目应至少包括灵敏度、特异性、重复性等内容。

稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

应对样本稳定性进行研究，主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果应分别在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（七）临床试验

临床试验总体要求及临床试验资料的内容应符合《办法》、“44号公告”及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的规定，以下仅结合抗人球蛋白检测试剂的具体特点对其临床试验中应重点关注的内容进行阐述。

1.研究方法

该类试剂已有同类产品上市，按照法规要求应选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称考核试剂）与之进行比较研究试验，证明本品与已上市产品等效。

2.临床试验单位的选择

应选择符合相关法规要求的临床试验机构进行临床试验，不得选择血站进行临床试验。

3.病例选择

临床总病例数应不少于3000例。应采用临床患者样本进行临床研究，供血者样本不得作为临床病例纳入。应包括对检测易产生干扰的病例，尽量选择多种疾病患者样本（如肿瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者）、老人、儿童（不同年龄段）等。

4.实验过程

无论直接抗人球蛋白试验还是间接抗人球蛋白试验，均应根据产品的预期用途和适用人群分别进行临床试验。

在进行间接抗人球蛋白检测试剂临床试验的过程中除与对比试剂进行比较外，阳性结果应给出不规则抗体的具体鉴定结果。

产品如适用于不同的预期用途（如不规则抗体筛查、抗体致敏红细胞检测、交叉配血等），每种预期用途均应分别进行至少3000例的临床试验，如适用于不规则抗体筛查或抗体致敏红细胞检测等，每种预期用途应分别包含不少于100例阳性病例，如适用于交叉配血相关用途，应包含不少于100例交叉配血不合病例。抗体致敏红细胞检测应根据疾病的种类，分别进行临床试验。

交叉配血使用的供血者样本，最多只能使用两次，交叉配血不得使用血型不合的样本进行实验。

同时应明确配合使用的试剂产品。

5.统计学分析

应进行考核试剂与对比试剂检测结果的阳性符合率、阴性符合率、总符合率的计算，并以四格表的形式进行列表，并对定性结果进行Kappa检验以验证检测结果的一致性。

6.结果差异样本的验证

对于两种试剂检测结果不一致[考核试剂与对比试剂检测结果不一致、与对比试剂凝集强度差异较大（差异2个凝集强度及以上）]的样本，应采用临床上公认较好的第三种同类试剂进行确认试验，同时应给出最终的抗体鉴定结果。

7.临床试验数据记录表应作为临床试验报告附件提交。临床试验数据记录表应列明所有病例的具体临床诊断信息、凝集强度和抗体鉴定结果，如有不符样本应列明第三方确认的结果。

（八）产品风险分析资料

产品风险分析资料应符合“44号公告”的基本要求，并参照相应的行业标准进行风险分析。风险分析中应充分考虑到各种可能影响检测结果的因素，如某些样本（如肿瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在进行抗人球蛋白检测时可能存在一定的干扰、实验过程不规范、有些抗体较弱导致的检测结果不稳定等，申请人应根据这些不确定的因素分析产品应用可能存在的风险。

（九）产品技术要求

申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、性能评估等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献，按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的有关要求，编写产品技术要求。产品技术要求应符合《办法》和“44号公告”的相关规定。

如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。

产品技术要求的性能指标应至少包括灵敏度、特异性、重复性等。

产品技术要求的附录应包括主要原材料、生产工艺及半成品检定要求。主要原材料应明确抗体来源、克隆号、纯度、效价、特异性以及功能性验证要求，应明确填充物来源及主要特征、质量控制要求，缓冲液应明确组成、pH值等特性及质控要求。主要生产工艺应以流程图形式描述主要生产工艺过程，并明确主要生产工艺的具体条件和质量控制点。半成品检定应明确半成品的检验要求及方法。

（十）产品注册检验报告

根据《办法》要求，首次申请注册的第三类体外诊断试剂产品应在国家食品药品监督管理部门认可的、具有相应承检范围的医疗器械检验机构进行连续三个生产批次样品的注册检验。

（十一）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、检验原理、试验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，境外产品的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明参考文献的相关信息。

以下内容仅对抗人球蛋白检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，说明书其他内容应根据《体外诊断试剂说明书编写指导原则》要求进行编写。

1.【预期用途】

1.1写明本试剂用于直接抗人球蛋白试验和/或间接抗人球蛋白试验，主要用于不规则抗体筛查、交叉配血、抗体致敏红细胞的检测（明确疾病类型）等，同时明确不用于血源筛查，仅用于临床检验。

1.2说明与预期用途相关的临床适应症背景情况，说明相关的临床或实验室诊断方法。

2.【储存条件及有效期】

说明试剂的储存条件及有效期、加速稳定性、开瓶稳定性等。

3.【适用仪器】明确具体的离心机和/或孵育器型号（如适用）。

4.【样本要求】

明确溶血、脂血、黄疸样本是否可以使用，或提供使用此类样本的最低要求。依据稳定性研究结果写明样本稳定性。

明确适用的抗凝剂的要求。

明确具体的样本采集、处理方法及过程。

明确红细胞配制使用的LISS液的生产厂家、规格、货号等内容。

5.【阳性判断值】

明确各种试验方法的结果判断方法及标准，并通过不同凝集强度的图例或照片进行详细解释。

6.【检验方法】

明确配合使用的抗体筛查用红细胞的生产厂家、规格、货号等内容。

须明确具体的检验步骤，反应体系的描述应准确且应与研究资料一致，不同的预期用途应分别详细描述实验过程。如配合其他试剂进行试验，需注明试验方法应完全符合配合试剂的试验操作要求。

7.【检验方法的局限性】

未被检出的抗IgG抗体在某些病例中可能有临床意义。

8.【注意事项】

8.1上腔部分或封口处有气泡或液滴的卡，必须在使用前离心。

8.2浓度过高或过低的红细胞悬液会引起异常结果。

8.3在不规则抗体筛查、交叉配血试验中LISS液可以增强抗原抗体的反应，应严格按产品说明书规范使用低离子液。

三、参考文献

1.国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂临床试验技术指导原则（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）.2014年9月

2.国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂说明书编写指导原则（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）.2014年9月

3.中国生物制品规程（2000年版）.化学工业出版社

四、起草单位

国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心。

第五篇：核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则3

附件3

核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则

一、前言

本指导原则主要针对核酸扩增类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。

本指导原则系对核酸扩增法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

本指导原则适用于核酸扩增法检测试剂的注册技术审查，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。

三、基本要求

（一）基本原则

1.核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

2．试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和

— 23 — 仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。

3.试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

4.核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。

5.企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。

（二）原材料

应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要原材料（包括生产工艺）或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。应为高效液相色谱（HPLC）纯、PCR级，无DNase和RNase污染。—20℃保存。— 24 — 2.引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用脱氧核糖核酸（DNA）合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。

冻干粉，序列正确，合成量应达到试剂生产要求。纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

应作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之间，可视为合格引物。-20℃保存。

3.探针

是指特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5'-端(和/或3'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。

冻干粉，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。应以可见—紫外分光光度计进行200—800nm扫描，在260nm处应有吸收峰。另外，根据标记荧光素的不同，还应该在荧光素的激发波长处有吸收峰，如FAM荧光素在494nm、TET荧光素在521nm、TAMRA荧光素在560nm处有特异的吸收峰，杂交探针在493nm、625nm、685nm处有特异的吸收峰，检定合格后入库。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃处理3分钟后，103拷贝以下含U模板应完全降解，不能产生扩增产物。-20℃保存。

6.逆转录酶

具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。—20℃保存。

（三）生产工艺

核酸扩增类检测试剂的基本生产工艺通常包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对电导率pH、等关键参数进行有效控制。

工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、临界值的确定、稳定性和有效期，提供确切的依据。

（四）质量控制 1.半成品质量控制

（1）按批号抽取规定数量的半成品。

（2）以参考品/对照品进行半成品质量控制。如果产品具有国家标准品或参考品，应以其进行检定。如果产品不具有国家标准品或参考品，应根据规定制备相应的企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（3）半成品检定内容包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度。检测结果应符合质量标准的要求。

（4）半成品检定合格后，按试剂盒组成及时进行分装和包装。2.成品质量控制

（1）每一批核酸扩增法检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。— 26 —（2）产品完成包装后，应根据生产量进行抽样和生产记录审核。（3）以参考品/对照品进行成品质量检验。结果应符合要求。（4）成品检验的内容应包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度、线性范围（定量产品）和稳定性。

5．试剂批放行前，应对需要进行稳定性考核的试剂成分，在特定温度或条件下进行稳定性试验。稳定性试验可采用加速破坏试验。

四、名词解释

核酸扩增法检测试剂：核酸扩增技术泛指以扩增脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）为手段，检测特定核酸序列或筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。

五、参考文献

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社